¿Cómo se realiza un “pase” de células?

Queridos lectores, hoy la entrada no pretende ser simplemente curiosa, pretende ser útil. Tras tratar de buscar de manera sencilla como se realiza un pase celular, técnica básica en cualquier laboratorio que trabaje con células, y ver que en los buscadores no es relativamente fácil llegar a esa información, he decidido tratar de aportar mi granito de arena al basto mundo de Internet.

Como algunos ya sabéis, estoy colaborando en el laboratorio de Biomedicina de la Universidad de las Islas Baleares, y la única referencia de como se realiza un pase celular, va a ser mi experiencia. ¡Vayamos a ello!

Material necesario para el inicio y mantenimiento de un cultivo celular.

Placas de cultivo celular, del tamaño indicado, que dependerá de la situación.

Diferentes placas de cultivo celular

Diferentes placas de cultivo celular

Medio de cultivo célular:  Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Simplemente, pide a tu superior que te ofrezca la receta y el material necesario para preparar tu medio, que deberás guardar a 4ºC preferentemente.

Antibióticos: Es preferible que añadas algunos antibióticos para evitar la contaminación de tus cultivos. Así por ejemplo, el medio de cultivo que yo empleo lleva:

  • RPMI, el medio básico (150 mL)
  • 10% suero bovino ( 50 mL)
  • Antibióticos: penicilina y estriptomicina (5 mL)
  • PBS hasta 500 mL

PBS es una solución tampón en la investigación biológica. Es una solución acuosa y salina que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Mientras que los grupos fosfato mantienen el pH estable, la osmolaridad coincide con la del cuerpo humano.

Tripsina: Su uso depende del tipo de células que empleemos. La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. Trypsin_EDTA_0_25_Solution

  • Las células pueden crecer en suspensión o de manera adherente. Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguíneo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensión.
  •  La tripsina se usa para despegar del “frasco” a las células que son adherentes, por lo cual, su uso se limita a este tipo de células.

Protocolo para realizar un pase celular 

Protocolo para el trabajo con células adherentes, que son las que he empleado y con las que sé trabajar, y las más comunes si no me equivoco, trataré de informarme lo antes posible y preparar otro protocolo para el trabajo con células en suspensión.

Los volúmenes indicados en este protocolo son correctos para el trabajo con placas de 75 mL, que son las más estándares, si el volumen de tu placa es diferente, el protocolo sigue siendo igual de funcional, pero tendrás que preguntar a la persona indicada que volúmenes se emplean.

1. Antes de comenzar, encender la campana, que debería estar en ultravioleta, y limpiarla en profundidad con EtOH 70% (Etanol 70%), limpiar también todo lo que vaya a entrar en la campana que haya estado en contacto con el exterior, botes, placas, pipetas…

2. Tendremos preparado lo que necesitaremos:

  • Medio completo, que deberá estar marcado con la fecha de creación, la linea celular donde se empleará, y el nombre del investigador que lo emplea. Importante marcar los botes con un permanente, y después poner celo encima de las letras para que el EtOH no nos lo borre.
  • PBS, marcado con la fecha de preparación y vuestro nombre.
  • Tripsina, marcado con la fecha de preparación y vuestro nombre.

Muy importante: Los botes no se deben abrir nunca en el exterior de la campana, ya que se contaminarían y al emplearlos sobre nuestros células, las contaminarían. Se deben abrir y cerrar dentro de la campana.

Cell_culture_media-set3. Trabajaremos con placas de 75 ml, tenemos que tener en cuenta que estas, si están en funcionamiento, tienen 15 ml de medio, donde encontraremos las células, en suspensión o, en este caso,  adheridas al frasco.

4. Absorber el medio de las placas que hemos cogido, si nuestras células son adherentes, ya que si están en suspensión y absorbemos el medio…¡absorberemos las células! Para las absorciones empleamos una especie de aspirador que funciona con puntas de pipetas Pasteur, que seguro que encuentras en tu laboratorio. Debemos colocar la punta aspiradora en una esquina, con el fin de no absorber las células adheridas al fondo. El material aspirado va a parara un bote que contiene lejia, con lo cual, las posibles células absorbidas morirán y dejarán de suponer un peligro biológico.

5. Vertimos 4-5 ml de PBS en la placa, que cubra toda la superficie en su totalidad. La función del PBS es limpiar los posibles restos de suero, que inhibe la tripsina que usaremos en el siguiente paso. Removemos bien hasta limpiar correctamente.

6. Absorbemos el PBS.

7. Vertimos 2 ml de Tripsina en la placa, que dejamos durante unos 2 minutos en la estufa a 37ºC, esto despega las células, pero debemos comprobarlo en el microscopio, previamente damos un pequeño golpe a la placa para ayudar a despegar.

Así se ven las células al microscopio

Así se ven las células al microscopio

8. Inactivamos la Tripsina con 8 ml de medio completo, dejando un volumen total de 10 ml en la placa. Ahora tendremos nuestra placa con las células que aún no se han podido adherir, y están en suspensión. Si por ejemplo, queriamos pasar las células a 1/2 (es decir, que la concentración del pase x+1 sea la mitad que en el pase x) , cogeremos tras agitar, 5 mL de nuestra placa, y los pasaremos a una placa nueva, donde por último añadiremos 10 mL de medio completo, ya que el volumen final de la placa debe ser de 15 mL.

Otro ejemplo para ayudar a entenderlo: Si tenemos 10 mL de nuestra placa “final”, tras inactivar la tripsina, y nos piden que hagamos un pase 1/5 , deberemos coger 1/5 de nuestro volumen de 10 mL, es decir, 2 mL, y ese volumen lo vertiremos en una nueva placa, a la que después añadiremos 15-2= 13 mL de medio completo.

9. Marcamos en la nueva placa:

  • Nombre
  • Línea celular
  • Fecha
  • Numero de pase (si nuestra placa inicial era X, está sera X+1)

9. Introducir la nueva placa en la estufa, a 37ºC, que es la mejor temperatura a la que crecen las células, la temperatura corporal.

Típica estufa de un laboratorio celular

Típica estufa de un laboratorio celular

11. ¡Ya tenemos nuestro pase realizado! Repetir el proceso para el siguiente pase.

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Si esta información le es de utilidad a alguien, la entrada cobrará sentido. Espero así que les sea útil, recuerden que trataré de preparar otro protocolo para células no adherentes, en cuanto recopile la información.

Un cordial saludo,

Javier Fernández.

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Acerca de Javier Fernández Díaz

Aprendiendo siempre cosas nuevas. Pasión por la ciencia.

Publicado el 3 noviembre, 2013 en Biología celular / molecular y etiquetado en , , , , . Guarda el enlace permanente. 2 comentarios.

  1. Me acuerdo que estuve haciendo durante dos meses cultivo de osteoblastos de ratón y con nervios para que no se contaminara. Pero todo salió muy bien 🙂

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