TFOs (Triplex-forming oligonucleotides), triple helice de ADN y sus aplicaciones.

Aplicaciones de los TFOs (oligonucleótidos inductores de la triple hélice) en la regulación de la expresión génica tanto como posible herramienta terapéutica  como herramienta en Biotecnología.

Los TFOs, que responden al término anglosajón de Triplex-forming oligonucleotides, son fragmentos de DNA de aproximadamente de 10 a 40 pares de bases, que se unen al surco mayor en una cadena normal (doble) de DNA, lo que resulta en la formación de una triple hélice de DNA. Esta unión ocurre únicamente en las regiones de polipurinas de una hebra, que tiene como hebra complementaria una región de polipirimidinas, mediante un enlace tipo puente de hidrógeno de Hoogsten a las bases purínicas (Adenina o Guanina) de la doble cadena de DNA que usualmente forma la más que conocida doble hélice de DNA de Watson y Crick.

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La habilidad de esta hebra que forma la triple hélice para unirse a una zona específica del genoma y su función como competidor con otras moléculas que tienen como misión unirse al DNA, hace que estos TFOs tengan diversas aplicaciones biotecnológicas e incluso terapéuticas. Principalmente como reguladores o alteradores de la expresión génica.

Los TFOs pueden regular la expresión génica a través de inducir mutaciones, es decir, funcionando como mutagénicos, realizando cambios genéticos heredables permanentes o incluso inhibición de algún paso de la transcripción. Los TFOs pueden unirse a una región determinada creando de esta manera una triple hélice en esa región, lo que forma una estructura física que funciona básicamente como impedimento a alguno de los procesos celulares normales como puede ser la transcripción.

Los TFOs han demostrado en diferentes experimentos que su empleo produce un aumento en la tasa de mutación de regiones específicas, al igual que un aumento en la posibilidad de recombinación, siendo estos una herramienta para aumentar la variabilidad génica de una determinada región.

El “gene targeting” es también una posibilidad debida a uno de los principios de la formación de esa triple hélice. La formación sólo posible en la secuencia de polipurinas en una hebra. Existe un código aún en estudio de unión de estos TFOs al DNA, basado en que los TFOs se unen a la hebra rica en purinas, lo que indica que se pueden hacer TFOs específicos para un determinado gen que cumpla con unas determinadas características. Basado en esa premisa se ha desarrollado un software que identifica zonas de afinidad para los TFOs (Vasquez,K.M. 2007).

La principal aplicación terapéutica de los TFOs es su utilización como inhibidor o regulador de la expresión génica. En sistemas modelo los TFOs han demostrado poder inhibir la expresión génica a nivel de DNA, inhibiendo el inicio o la elongación de la transcripción en un gen determinado. Gran parte las terapias actuales antitumorales, se basan en intentar inhibir la expresión de oncogenes, una de las más conocidas causas de cáncer, es por ello que los TFOs como inhibidores de la expresión génica pueden tener importancia en la terapia antitumoral.

walterDNA2Las mejoras en la estabilidad de las triples hélices en condiciones fisiológicas pueden colaborar con la idea de que la terapia inhibidora de genes mediante TFOs puede ser efectiva, ya que antaño las triples hélices sólo podían ser formadas en condiciones experimentales no fisiológicas, lo que reducía sus posibilidades terapéuticas prácticamente a cero.  Además se ha observado que estas triples hélices se forman de forma más abundante en las zonas reguladoras, concretamente en las zonas promotoras, lo que incrementa de nuevo su capacidad como reguladores de la expresión de determinados genes. Recordando siempre la limitación de que estos genes deben estar en una zona de polipurinas.

Los TFOs pueden ser utilizados para targeting de drogas en estudio (Mateucci, M. 1997). Ya que los TFOs pueden formar triple hélice en zonas determinadas del genoma, puede darse al fármaco afinidad por los TFOs y de esta forma el fármaco o compuesto accederá en mayor cantidad a la zona destino que al resto, a las cuales accederá pero de manera menos significativa. Esto aumenta la especificidad del compuesto de una manera dependiente a la secuencia, lo que permite reducir los efectos secundarios no deseados debido a la inespecificidad de los compuestos.

A pesar de estas teóricamente viables posibilidades terapéuticas, la gran mayoría de patologías requieren que se corrijan la mayoría de células mutadas en el tejido, lo cual no es viable mediante esta metodología de triples hélices, ya que la formación de estas triples hélices en todas las células resulta poco probable o cuanto menos, muy complicada. Sin embargo, en enfermedades hematológicas donde una corrección de un pequeño número de células puede mostrar una mejora fenotípica de la patología, esta tecnología puede jugar un papel interesante. Otros científicos defienden que en el primer caso donde es necesario cambiar un gran porcentaje de las células, esta tecnología puede ser útil si se aplica a unas pocas, que tomarían una ventaja en el crecimiento por su mejores características, lo que llevaría a la expansión de la población de células corregidas.

Las oportunidades biotecnológicas de las triples hélices que forman los TFOs no pasan únicamente por la terapéutica. Son diversas las aplicaciones que sin relación directa con la terapéutica  pueden ayudar a elucidar mecanismos de acción o características de algunas regiones de DNA con el consiguiente conocimiento asociado, y su posible utilización indirecta en terapéutica.

Una de las aplicaciones biotecnológicas de los TFOs puede pasar por reconocer lugares del DNA donde se unen proteínas o otras moléculas, debido a que la tercera cadena puede actuar como competidor con las moléculas y proteínas que van a unirse al DNA. Pueden marcarse de forma fluorescente los TFOs y observar como estos se desplazan por la acción de una enzima translocadora cuando un compuesto diferente se une.

Se ha observado también que la triple cadena de TFOs puede terminar siendo circularizada alrededor de la zona de targeting, si esta cadena sufre un marcaje por fluorescencia, esa estructura puede ser visualizada de forma fácil. Siendo una cadena de TFOs con esas características la primera secuencia no repetida, realmente corta, de 15 pares de bases, que puede ser vista un microscopio óptico (Escudé. C., 1999)

En otro experimento (Hausmann,M., 2003) se introdujeron oligonucleótidos hibridados in situ (COMBO-FISH) , de forma que los TFOs quedan marcados por fluorescencia. Estos TFOs funcionan como sondas que tienen utilidad para  marcar cromosomas en el núcleo celular en condiciones no desnaturalizantes, en condiciones fisiológicas e incluso en células vivas (Van Daele, I. 2008).F5.large

Una de las aplicaciones más antiguas de los TFOs es el reconocimiento y la purificacion de acidos nucleicos. La característica de que la triple hélice se forme únicamente en hebras con largas secuencias de purinas, puede utilizarse para seleccionar y diferenciar ese tipo de cadenas (que tienen una hebra con abundancia de purinas y la complementaria con igual abundancia de pirimidinas) en una colección de diferentes muestras de DNA (Ji,H. and Smith,L.M. 1993).

A modo de resumen, los TFOs son una herramienta relativamente reciente y sumamente curiosa (¿Quien pensaba en una triple hélice de DNA?) a la que se le han encontrado diversas aplicaciones, principalmente derivadas de que su formación requiere de una hebra con una secuencia de polipurinas. La necesidad de tratamientos diferentes en numerosas áreas, principalmente en la oncológica, ha impulsado los estudios en base a la actividad silenciadora de genes de esta triple hélice. Aparentemente estas triples hélices son predominantemente inexistentes en la naturaleza, aunque parece haberse encontrado en células humanas una cuádruple hélice de DNA, lo que hace pensar en la viabilidad real de esta técnica en estudios terapéuticos in vivo, y de forma más aguda en patologías donde se requiere un cambio en gran parte de la población celular mutada. Futuros estudios pueden ofrecer respuestas acerca de la utilidad o no utilidad de esta técnica en la biotecnología y especialmente en la terapéutica, cuanto menos, es un curioso ejemplo de que la vida celular está llena de excepciones y sorpresas.

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Acerca de Javier Fernández Díaz

Aprendiendo siempre cosas nuevas. Pasión por la ciencia.

Publicado el 21 noviembre, 2014 en Biología celular / molecular y etiquetado en , , , , , , . Guarda el enlace permanente. Deja un comentario.

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