Secuenciación por bisulfito (“bisulfito mapping”) ¿Qué es y para qué se utiliza?

¿En qué consiste el método de mapeo con bisulfito (del inglés “bisulfito mapping) y para qué se utiliza?

La epigenética es la ciencia que estudia todos los factores no genéticos, es decir, que no implican un cambio en la secuencia de nucleótidos de la cadena de DNA, pero que afectan a la regulación de la expresión génica, pudiendo ser algunos de estos factores incluso heredables. La epigenética es, en resumen, el conjunto de procesos químicos que modifican la actividad del DNA pero sin alterar la secuencia.

Para el estudio de la epigenética es interesante la aplicación de una variante del método Sanger de secuenciación, el método conocido como secuenciación por bisulfito, o en inglés. “bisulfito mapping”.

La secuenciación por bisulfito permite realizar un mapeo de metilaciones alelo-específicas en las islas CpG, añadiendo la posibilidad de observar las metilaciones además de la secuencia nucleotídica. Las islas CpG son regiones de DNA ricas en pares de citosina y guanina enlazados por fosfato, que son especialmente abundantes en las regiones promotoras de los genes. La citosina de estas islas puede metilarse y desmetilarse, siendo este uno de los principales y más estudiados mecanismos epigenéticos. Si la citosina está metilada, se produce la atracción de proteínas que condensan la cromatina y se produce el silenciamiento del gen, si la citosina está desmetilada, significará usualmente que los genes están expresándose.

En el método de secuenciación por bisulfito, se extrae el DNA a secuenciar y se fragmenta con el fin de facilitar la posterior desnaturalización por calor, obteniéndose así a partir de una cadena de DNA, dos hebras. Posteriormente se incuba la muestra en presencia de bisulfito (NaHSO3). El bisulfito actúa desaminando las citosinas del DNA convirtiendo estas en uracilo. La base del método es que el bisulfito por sus propiedades físico-químicas es incapaz de actuar sobre las citosinas que se encuentren metiladas, que son conocidas como 5-metilcitosina. Una vez realizada la incubación se realiza una amplificación de la región que queremos mapear por PCR y se secuencia de forma normal. Para el mapeo de las metilaciones, se compara la secuencia obtenida con la de una secuencia control que no ha sido sometida a la acción del bisulfito: aquellas citosinas que estuviesen metiladas aparecerán tras la PCR y secuenciación como citosinas, mientras que en la muestra tratada donde el bisulfito las transformó en un uracilo, finalmente serán observadas como una timina.

Secuenciación_con_bisulfito

 

A pesar de la amplia utilización del método de secuenciación por bisulfito en estudios epigenéticos, existen unas series de limitaciones que conviene tener en cuenta a la hora de su utilización.

  • El conocimiento de la presencia de un nuevo tipo de modificación en las citosinas, quedando finalmente las citosinas como 5-hidroximetilcitosinas. El bisulfito que transforma normalmente las citosinas metiladas en uracilo, no es capaz de hacerlo con las 5-hidroximetilcitosinas, que son transformadas a citosina-5-metilsulfonato por el bisulfito. Esta última es leída en la secuenciación como una citosina normal, por lo que el bisulfito no es capaz de dar información de las citosinas metiladas de esta otra manera. Aún así, se ha desarrollado un método válido para solucionar esta limitación:  Yu, M., Hon, G. C., Szulwach, K. E., Song, C., Jin, P., Ren, B., He, C. Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Protocols 2012, 7, 2159.
  • El método de secunciación por bisulfito se basa en que tras el tratamiento con bisulfito, todas y cada una de las citosinas no metiladas serán transformadas en uracilo. Si esto no sucediera (una efectividad del 100% es difícil en procesos de esta índole), las citosinas no metiladas no transformadas serían interpretadas como citosinas metiladas, dando así posibles casos de falsos positivos para la metilación. Como únicamente las citosinas que se encuentran en la hebra simple de DNA son susceptibles para el ataque y modificación por el bisulfito, para evitar o reducir al máximo estos falsos positivos, cabe prestar especial atención a los parámetros escogidos para la desnaturalización y separación de la cadena doble de DNA en dos hebras simples.
  • El bisulfito es agresivo con el DNA, lo que resulta en que simultáneamente, mientras se transforman las citosinas no metiladas, otras partes del DNA son dañadas y degradadas. Se ha estudiado que debido a las condiciones en las que el método se desarrolla (altas temperaturas, largos tiempos de incubación y altas concentraciones de bisulfito), se puede llegar a degradar hasta un 90% del DNA incubado. Teniendo en cuenta que usualmente la cantidad de DNA de partida antes de la amplificación es limitada, la excesiva degradación puede resultar en un problema significativo.
  • Una alcalinización inadecuada de la solución, que resulta en un pH inadecuado, puede dar lugar a la desulfonación incompleta de los residuos de pirimidina, lo que a su vez inhibe la actividad de algunas DNA polimerasas. Esto finalmente resulta en una amplificación difícil o incompleta en la PCR. Se puede evitar este problema monitorizando el pH de la solución para asegurarse que la alcalinización es correcta y con ello la desulfonación de las pirimidinas será completa.
  • Por último, el tratamiento e incubación con bisulfito reduce el nivel de complejidad de la muestra, dejando cada vez muestras de DNA más cortas, lo que finalmente dificulta la creación de primers y la hibridación cruzada, e incrementa el número de errores posibles durante la amplificación por PCR, especialmente si va a realizarse múltiples veces dicha amplificación.

A pesar de las limitaciones, si estas se tienen en cuenta, la secuenciación por bisulfito resulta en un método interesante para el estudio de las metilaciones en las citosinas de las islas CpG, un mecanismo epigenético importante en la expresión genética y que puede formar parte del mecanismo de acción de muchas patologías.

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Acerca de Javier Fernández Díaz

Aprendiendo siempre cosas nuevas. Pasión por la ciencia.

Publicado el 24 noviembre, 2014 en Biología celular / molecular y etiquetado en , , , , , , . Guarda el enlace permanente. Deja un comentario.

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